extract from: Kutane Microzirkulation

Laser Doppler Anemomterie

P. Altmeyer, K. Hoffmann, M. Stücker

4.3 Laser Doppler Anemometrie

Der Laserstrahl in der sogenannten Laser Doppler Fluxmetrie hat in der Regel einen Durchmesser von 250-800 µm. Strahlt man ein derartiges Laserlicht in die Haut, streut es isotrop in alle Richtungen und es resultiert ein halbkugelförmiges Meßvolumen von etwa 1 mm Durchmesser. Mit Hilfe des optischen Dopplereffektes und entsprechender Frequenzverschiebungen ist es möglich die Verteilung der Blutzellgeschwindigkeiten in diesem Meßvolumen zu bestimmen. Es ist jedoch nicht möglich, die Blutzellgeschwindigkeit in einem einzigen Gefäß zu bestimmen, da der Querschnitt des Laserstrahls zu groß ist und immer mehrere Gefäße gleichzeitig erfaßt werden. Um die Blutzellgeschwindigkeit in einem einzigen Gefäß messen zu können, muß der Durchmesser des Laserstrahls so stark eingegrenzt werden, daß er nur ein Gefäß trifft und alle Dopplerfrequenzen in einem einzigen Gefäß generiert werden. Bei Gefäßdurchmessern im Hautgefäßsystem zwischen 8 µm in den Kapillarschleifen bis zu 35 µm in den Arteriolen (Uraverman 1989) muß man den Laserstrahl daher auf weniger als ein Zehntel des Durchmessers eines im herkömmlichen Laser Doppler Fluxmetrie-Gerät verwendeten Laserstrahls reduzieren.
Dies ist bei den sogenannten Laser Doppler Anemometern der Fall. Bei ihnen ist der Durchmesser des Laserstrahls im Meßvolumen durch optische Fokussierung stark eingegrenzt und somit sind Messungen der absoluten Geschwindigkeit oder von Geschwindigkeitsprofilen in einem einzigen Gefäß möglich. Zur Messung der Geschwindigkeit im kapillären Strombett und in kleinen Gefäßen wie den Arteriolen werden Laser Doppler Anemometer mit Mikroskopen kombiniert und dann entweder mikroskopische Laser Doppler Anemometer oder Laser Doppler Mikroskope genannt. Laser Doppler Anemometer sind bei weitem nicht so verbreitet wie die herkömmlichen Laser Doppler Fluxmeter. Erst vor kurzem wurde erstmals ein Gerät entwickelt, mit dem Geschwindigkeitsmessungen in Kapillaren der menschlichen Haut auch außerhalb der oberflächenparallel verlaufenden Kapillarschlingen möglich sind.

4.3.1 Geschichte der Laser Doppler Anemometrie

Laser Doppler Anemometer wurden erstmals zur Messung der Geschwindigkeit von sogenannten Erythrozytenghosts (Erythrozytenattrappen) eingesetzt (Kreid und Goldstein 1971). Diese Geräte arbeiteten mit einem stark gespreizten Laserstrahl, wodurch das Meßvolumen deutlich größer als der Gefäßdurchmesser wurde und nur schwer ein einziges Gefäß getroffen werden konnte. Dies führte zur Entwicklung von Laser Doppler Anemometer Mikroskopen, mit denen der Laserstrahl gezielter auf ein Gefäß adjustiert werden kann (Einev et al. 1975, Mishina et al. 1975) und die Blutzellgeschwindigkeiten in Gefäßen mit einem Durchmesser von nur 65-98 µm gemessen werden können. Die Suche nach Laser Doppler Anemometern mit noch besseren Auflösung und damit noch kleinerem Meßvolumen führte zur Entwicklung von sogenannten Interferenz Anemometern. Hierbei wird der Laserstrahl mittels eines optischen Systems aus Spiegeln und Prismen gespalten und im Meßfokus wieder zusammengeführt, so daß ein sogenanntes Interferenzmuster entsteht. Dadurch läßt sich in einem relativ kleinen Meßvolumen auch in waagerecht verlaufenden Gefäßen eine hohe Lichtintensität erzeugen. Passieren Erythrozyten dieses Interferenzmuster, werden entsprechend viele Dopplerfrequenzen generiert. Basierend auf der Interferenztechnik wurden sowohl Transmissionsanemometer entwickelt, bei denen die Dopplerfrequenzen auf der zum Lichteinfall gegenüberliegenden Seite detektiert wurden, als auch Reflexionsanemometer, bei denen das reflektierte Licht an der Seite empfangen wird, an der es eingestrahlt wurde. Auch die Interferenz-Anemometer wurden mit Mikroskopen kombiniert (Einev et al. 1975, Born et al. 1978, Le-Cong und Zweifach 1979), allerdings nur zur tierexperimentellen Bestimmung der kapillären Blutzellgeschwindigkeit und von Geschwindigkeitsprofilen verwendet (z.B. Arteriolen im Mesenterium des Hamsters) (Einev und Berman 1988, Le-Cong und Zweifach 1979, Einev et al. 1988). Ähnlich den kapillarmikroskopischen Systemen waren diese Systeme zur Messung der kapillären Blutzellgeschwindigkeit in Gefäßen, welche waagerecht in der Bildebene liegen, konzipiert. Der Dopplershift erfolgt jedoch nur, wenn die Photonen des Lichtes nicht senkrecht auf die Teilchen treffen, welche sich in den Gefäßen bewegen. Deshalb mußte der Laser Fokus zur Untersuchung parallel zur Bildfläche verlaufender Gefäße so breit gehalten werden, daß genügend Photonen die Teilchen in einem flacheren Winkel als 90° trafen. Dadurch konnte der Fokusdurchmesser des Laserstrahls nicht so stark reduziert werden, daß man wirklich nur eine einzige Kapillare traf. Deshalb wurden über viele Jahre keine anemometrischen Messungen an den Gefäßen der menschlichen Haut durchgeführt. Von manchen Autoren wurde diese Technik bereits als historisch angesehen (Shephard und Öberg 1990). Neuere Entwicklungen haben nun zum Ziel, die Blutzellgeschwindigkeit in Gefäßen zu messen, welche senkrecht zur Hautoberfläche liegen. Bei dieser Meßanordnung treffen die Photonen des Lichtes steil auf die Erythrozyten in den Gefäßen und man kann deshalb den Laser so stark fokussieren, daß das Licht auf eine einzige Kapillare trifft (Stücker et al. 1996). Erste in vivo Messungen an Kapillargefäßen der menschlichen Haut wurden bisher durchgeführt.

4.3.2 Mikroskopische Laser Doppler Anemometer

4.3.2.1 Meßprinzip

Das Meßprinzip des Laser Doppler Anemometers zur Messung der kapillären Blutzellgeschwindigkeit in der Haut unterscheidet sich von der Laser Doppler Fluxmetrie im wesentlichen durch den geringeren Querschnitt des Laserstrahls. Laserlicht wird in das Gefäß gelenkt, in dem die kapilläre Blutzellgeschwindigkeit gemessen werden soll. Ein Teil des Lichtes wird an sich bewegenden Erythrozyten reflektiert, ein Teil an den Gefäßwänden.
Während der Teil des Lichtes, der ausschließlich an den Gefäßwänden reflektiert wird, in seiner Frequenz nicht verändert wird, enthält der Teil des reflektierten Lichtes, welcher an den Erythrozyten reflektiert wurde, durch den Dopplershift neu entstandene Frequenzen. Das reflektierte Licht wird mittels eines Photodetektors aufgenommen und in einen Photostrom umgewandelt. Mit Hilfe einer Frequenzanalyse des Photostroms wird dann entsprechend dem Dopplergesetz die Blutzellgeschwindigkeit bestimmt.

Zur Zeit ist nur ein Laser Doppler Anemometer zur Messung der kapillären Blutzellgeschwindigkeit in den Kapillaren der Haut kommerziell erhältlich (Laser Doppler Anemometer CAM-1, KK-Technology, England) (Abb. 22).
Als Lichtquelle dient eine 1,5 mW Laser Diode, welche Licht der Wellenlänge 780 nm emittiert. Dieses Licht wird mit Hilfe eines Objektivs auf einen Fokus von 10 µm Durchmesser fokussiert, wodurch die kapilläre Blutzellgeschwindigkeit in Kapillaren mit einem Durchmesser von 9,8-32,1 µm gemessen werden kann. Über ein Mikroskop mit CCD-Kamera kann unter optischer Kontrolle der Laserstrahl in eine einzelne Kapillare projiziert werden (Abb. 22). Die Objektivlinse sammelt das vom Gewebe reflektierte dopplergeshiftete und nichtgeshiftete Laserlicht, welches mit Hilfe von Spiegeln zum Photodetektor gelenkt wird. Der Photodetektor erfaßt die Vermischung ("Heterodyning") dieser optischen Signale. Aus den Differenzen der Frequenzen kann dann nach Signalverarbeitung die Fließgeschwindigkeit berechnet werden.

4.3.3 Klinische Anwendung

4.3.3.1 Untersuchungslokalisation

Die Wahl der Untersuchungslokalisation richtete sich stets nach der Fragestellung. Messungen in allen Körperregionen sind möglich, ein Problem können die Atemexkursionen darstellen.

4.3.3.2 Untersuchungsprozedere

Das Untersuchungsprozedere gleicht sehr dem Prozedere bei einer herkömmlichen kapillarmikroskopischen Untersuchung. Der Patient oder Proband akklimatisiert sich zunächst in der Untersuchungsposition über einen Zeitraum von etwa 20 Minuten. Dann wird die Untersuchungsstelle gut fixiert, so daß einerseits keine Bewegung im Untersuchungsfeld ist, andererseits jedoch die Durchblutung der Kapillaren nicht alteriert wird.
Bei Messungen an den Armen oder den Fingern ist eine sitzende Haltung mit Lagerung der Extremität in Herzhöhe sinnvoll.

4.3.3.3 Normalwerte

Ruheflußgeschwindigkeit

Die mittlere kapilläre Ruheflußgeschwindigkeit am dorsalen Grundgelenk des Zeigefingers betrug bei 22" Raumtemperatur 0,47 mm/s (SD - 0,37 mm/s) (Stücker et al. 1996). Die in diesen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse stimmen damit in der Größenordnung mit den Werten anderer Meßtechniken überein. Die mittlere kapilläre Blutzellgeschwindigkeit war jedoch mit 0,47 mm/s geringfügig niedriger als die Werte, die mit den kapillarmikroskopischen Systemen in den Nagelfalzkapillaren gemessen wurden (Tab. 25). (Bollinger et al. 1974, Butti et al. 1975, Fagrell et al. 1977a).
Dies kann auf verschiedene Ursachen zurückgeführt werden. Ein Grund sind die unterschiedlichen Meßstellen. Die anemometrischen Daten stammen von Kapillaren des Fingergrundgliedes, während die übrigen zitierten Untersuchungen an Nagelfalzkapillaren durchgeführt wurden. Aufgrund der oberflächenparallelen Anordnung können in diesen Kapillaren besonders gut kontrollierbare Messungen durchgeführt werden. Bei dem mikroskopischen Blick auf den Apex der Kapillaren mit dem Mikroskop des Laser Doppler Anemometers kann die sichere Unterscheidung des arteriellen und venösen Schenkels bisweilen problematisch sein. Dadurch könnten auch niedrigere Blutzellgeschwindigkeiten aus dem venösen Kapillarschenkel Eingang in die Messungen gefunden haben. Ähnlich den kapillarmikroskopisch gemessenen Geschwindigkeitswerten (Bollinger et al. 1974, Butti et al. 1975, Fagrell et al. 1977 b+c, Östergren 1984, Richardson 1982) zeigen auch die mit Hilfe der Laser Doppler Anemometrie bestimmten Geschwindigkeiten eine recht hohe intra- und interindividuelle Varianz. So liegen die absoluten Werte bei einer Raumtemperatur von 21"C in einem Bereich von 0,14 bis 0,93 mm/s bei verschiedenen Individuen. Sogar in Kapillaren, die unmittelbar benachbart liegen, kann ein asynchroner Fluß mit unterschiedlichen kapillären Blutflußgeschwindigkeiten gemessen werden. Mißt man die Geschwindigkeit in fünf benachbarten Kapillaren eines Probanden, so differiert die minimale von der maximalen Geschwindigkeit im Mittel um 0,3 ± 0,18 mm/s. Die maximale Differenz der Fließgeschwindigkeiten benachbarter Kapillaren beträgt bis zu 0,63 mm/s (Stücker et al. 1996) (Abb. 23). Eine Erklärung für die Varianz der Geschwindigkeitswerte ist die hohe räumliche und zeitliche Inhomogenität der kutanen Mikrozirkulation. Kapillaren mit unterschiedlichen Kapillardurchmessern zeigen verschiedene Geschwindigkeitsprofile, wobei die Geschwindigkeit mit zunehmendem Durchmesser abnimmt.

Kälte- und Wärmeprovokation

Nach einem Eiswasser-Handbad bei 4"C über 2 min zeigt sich bei einer Ruhegeschwindigkeit in den Gefäßen von 0,41 f 0,25 mm/s ein signifikanter Abfall der kapillären Blutflußgeschwindigkeit auf 0,28 -t 0,11 mm/s (p L 0,003). Nach einem Warmwasserbad bei 32"C über 4 min ließ sich anemometrisch ein Anstieg der kapillären Blutflußgeschwindigkeit auf 0,78 ± 0,34 mm/s erfassen (p 10,001) (Stücker; et al. 1996). Dies entspricht den bisher beschriebenen Ergebnissen von den Nagelfalzkapillaren (Gasser und Berger 1990, Mahler et al. 1986, Nilsson et al. 1986). Bis zu einer Hauttemperatur von 32"C steigen die Kapillarfließgeschwindigkeiten nur mäßig an. Erst bei einer Hauttemperatur von über 32"C steigt die Geschwindigkeit deutlicher an (Fagrell et al. 1977, Fagrell et al. 1980, Mahler et al. 1986, Östergren 1984). Diese Befunde an den Nagelfalzkapillaren konnten anemometrisch für die senkrecht zur Hautoberfläche stehenden Kapillaren bestätigt werden (Abb. 24). Dies spricht für eine zumindest ähnlich hohe Sensitivität der Laser Doppler Anemometrie für kurzzeitige Geschwindigkeitsänderungen des Blutflusses in den Kapillaren im Vergleich zu den anderen kapillarmikroskopischen Techniken. Die Temperaturprovokation mit den Wasserbädern ist jedoch schlecht reproduzierbar (r = -0,04 nach Kühlung, r = -0,28 nach Erwärmung). So fällt nicht bei allen Probanden nach einem Eiswasserbad die kapilläre Blutflußgeschwindigkeit ab, sondern bei einigen steigt die kapilläre Blutflußgeschwindigkeit an, was auf den Beginn einer hyperämischen Reaktion hindeuten kann.

Suprasystolische Stauung

Wie in anderen Untersuchungen (Bollinger und Fagrell 1990, Fagrell et al. 1977; Fagrell and Intaglietta 1977) waren auch in den Untersuchungen mit dem Anemometer die maximale postokklusive kapilläre Blutzellgeschwindigkeit (0,90 ± 0,46 mm/s) und das Zeitintervall zwischen dem Öffnen der suprasystolischen Stauung und dem Erreichen der Maximalwerte gut reproduzierbar (24,9 & 9,2 s). Die Streuung der Ruhewerte (0,47 ± 0,37 mm /s) und des prozentualen Anstiegs der kapillären Blutzellgeschwindigkeit (11S%) nach Öffnen der Okklusion ist hingegen größer, was bereits aus Untersuchungen mit der Cross-Correlation Methode bekannt ist (Östergren and Fagrell 1986). Im Vergleich zu den Meßergebnissen, welche nach Kühlung gemessen werden konnten, scheinen die Meßwerte nach suprasystolischer Okklusion besser reproduzierbar. So betrug der Korrelationskoeffizient für die postokklusive Maximalgeschwindigkeit r = 0,67 (p = 0,002) und für die Zeit bis zum Maximalanstieg nach Okklusion sogar r = 0,97 (p = 0,0001) (Stücker et al. 1996).

Hyperämie nach Applikation von Rubefaziens

30 Minuten nach Applikation eines Rubefaziens (Kombination aus Nicoboxil und Nonivamid, Finalgon^® ) zeigt sich ein signifikanter Anstieg der kapillären Blutflußgeschwindigkeit von 0,47 ± 0,37 mm/s auf 0,74 ± 0,48 mm/s (p <= 0,04). Bei wenigen Patienten kann ein Abfall registriert werden (Abb. 25).

4.3.4 Methodenvergleich und Ausblick

Die Laser Doppler Anemometrie ist als einzige Methode zur Quantifizierung der kapillären Blutflußgeschwindigkeit in senkrecht zur Hautoberfläche stehenden Kapillarschlingen konzipiert und eröffnet somit neue Anwendungsgebiete und Fragestellungen. Im folgenden seien die derzeit gängigen Methoden zur Bestimmung der kapillären Blutzellgeschwindigkeit kurz miteinander verglichen.
Bei der frame-to-frame Technik wird die kapilläre Blutzellgeschwindigkeit anhand der von Videobild zu Videobild weiterfließenden Plasmalücken bestimmt (Bollinger et al. 19j4, Bollinger et al. 1976). Ein wesentlicher Nachteil dieser ansonsten als Goldstandard anzusehenden Methode ist der große Zeitaufwand, der mit der Bestimmung der kapillären Blutflußgeschwindigkeit verbunden ist. Dadurch ist es fast unmöglich, spontane Fluktuationen der kapillären Blutzellgeschwindigkeit zu erfassen (Bollinger und Fagrell 1990).
Mit der Flink Spot Methode (Brandmarkt et al. 1963; Gase and Berger 1992; Jakobs 1385; Tyml and Ellis al. 1 982) können insbesondere langsamere Blutzellgeschwindigkeiten quantifiziert werden. Höhere Geschwindigkeiten und spontane Fluktuationen werden hingegen schlechter erfaßt (Bollinger und Fagrell 1990).
Die Cross-Correlation Technik (Fagrell et al. 1977 a, b, c; Intaglietta et al. 1975) zeichnet sich durch eine gute Sensitivität auch für kurzfristige und kurzzeitige Geschwindigkeitsänderungen aus, erfordert aber eine hervorragenden Bildqualität, die in krankhaften Zuständen oftmals nicht erreicht wird (Fagrell et al. 13 77 a+b; Intaglictta et al. 1 9 75). Ein groß er Vorteil dieses Systems ist die implementierte automatische Bewegungskorrektur. Allerdings sind für die Bewegungskorrektur kontrastreiche unbewegliche Strukturen erforderlich, die sich in vivo oft nicht finden. Ein derartiger Korrekturmechanismus ist für die Anemometrie derzeit nicht möglich, man kann jedoch mit einem akustischen Signal die Lage des Laserstrahls während der Messung kontrollieren. Man kann drei wesentliche Vorteile der Laser Doppler Anemometrie festhalten:

1) Nur mit der Laser Doppler Anemometrie ist es möglich, die Geschwindigkeit in Kapillaren zu messen, die senkrecht zur Hautoberfläche liegen, was für fast alle Körperregionen zutrifft.
2) Geschwindigkeiten von 0,1 mm/s bis 14 mm/s sind meßbar, so daß alle physiologisch vorkommenden kapillären Blutzellgeschwindigkeiten erfaßt werden können.
3) Alle Messungen werden on-line durchgeführt und können somit leichter im klinischen Alltag eingesetzt werden.